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[文献精读] 如何鉴定游离DNA的身份

2017-08-24 00:00来源：原版作者：Jerry Li

血液中的游离DNA（cfDNA）是液体活检的首要关注点。为了精准检测这些游离的DNA片段, 买球网就需要关注游离DNA的基本特征，比如浓度、片段大小、序列、稳定性等【1-4】。但是更重要的问题，是怎样鉴定这些游离DNA的身份。身份指导行为。比如说买球网有了新同事或是新邻居，好奇的买球网首先想要知道新人的身份，从哪里来，以前做过什么，这样基本可以预测这人的行为。根据同样的思路，买球网关注游离DNA的身份，即它们从哪里来，到哪里去，哪些是靶向DNA, 哪些是干扰DNA, 哪些DNA在哪些生理环境下有哪些生物学行为。这些知识无疑会帮助买球网设计更新更好的，来稳定、保护和检测游离DNA。

在液态活检的科研领域，买球网可以借助目前已经建立了的模型，来总结游离DNA的行为特征，从而鉴定其身份。在这里买球网重点讨论血液凝集系统和创伤系统，这两个系统的特点是它们都有非常讯速变化的血液环境。这样的环境里，游离DNA的水平处于显著的动态变化中，这就为买球网提供了非常独特和宝贵的视角，为买球网阐释了游离DNA身份提供了依据。

1．从血液凝集看游离DNA动态变化

血浆和血清作为最常见的血液样品，分别是采血系统的抗凝和促凝的产物，它们内含的游离DNA的水平有很大差异【5-12】。在配对对比试验中，科研人员对同一患者的血样在其他条件都对等的条件下，对比分析了血浆样品和血清样品，发现血清里的游离DNA的水平是血浆的14倍【5】到20倍【6】。这里指的是新鲜血清和血浆的比对，如果观察贮存的样品，人们发现血清内的游离DNA水平在稳步上升，在4°C的环境里保存5天的血清样本，游离DNA的水平可以在本底基础上进一步提高100倍，而同等条件下的血浆里游离DNA的水平基本不变【6】。

由于血清是血液凝集后的产物，一系列的级联凝集反应导致血小板富集，化学介质释放，核酸以及核酸酶释放，这些都是导致血清中DNA水平的变化的可能原因。买球网已经知道的是，血清中升高的DNA有相当部分是来自白细胞中释放的基因组DNA。这些DNA不仅量很高，水平和化学性质也很不稳定【13-15】。更重要的是，对于液体活检项目中买球网关注的靶分子，比如无创产检中的胎儿DNA, 血清中的量反而比血浆中更少【16】。这很可能来自于白细胞释放的DNA酶对于游离DNA的降解作用。

2．血清不适合做液体活检的样品

液体活检样品的大忌就是（1）相关DNA的量小，（2）无关DNA的量大。这两点在血清中都体现出来了。那么血清是否是不适合做液体活检的样品？买球网来看看肿瘤监测的情况，因为肿瘤监测相对于产检、创伤监测这些常规检查，肿瘤监测的难度更大，是液体活检的终极挑战。在【17】肺癌患者的血浆对血清的配对对比实验中，血浆检测可以看出患者的游离DNA的量显著地高于健康人（24.5ng/mL vs 5.1ng/mL）, 而血清检测的结果显示肺癌患者和健康人的游离DNA水平是一样的。也就是说，在液态活检的高难度项目中，使用血浆是比血清能更有效地检出肿瘤的存在。液体活检的样品准备对结果有直接影响，血清样品因为其高水平的基因组DNA以及核酸酶，给液体活检的靶分子检测提高了难度，因而不适合做液体活检。

买球网同时应该看到，血液样品中的游离DNA是处于动态变化的，即便是血浆样品，它内部的游离DNA水平也在稳步提高。同样是血浆样品，在常规采血管（比如EDTA管）中的游离DNA可能比特殊采血管（比如BCT）中高上百倍【18】。所以对于液体活检的样品处理，使用细胞稳定剂来稳定血液细胞，是保护cfDNA是根本的解决办法【19-23】。关于血细胞的稳定和血液样品贮存运输，可以参照买球网的《液体活检通讯-2017.6：样本处理对cfDNA和液体活检的影响》。

3. 从创伤看游离DNA的消长

如果说血清样品中游离DNA变化是局部的、人为促成的，那么创伤（trauma）过程中游离DNA变化则反映了整体的、有机的变化，所以能更加有信服力第说明游离DNA的动态和来源。根据对创伤患者的检测，患者血液中游离DNA的水平是无一例外是升高的【24-35】。经典的研究发现在创伤发生的20分钟内，血液中游离DNA的水平就能够被检出有显著升高【24】。如果患者的创伤情况在几小时内稳定下来，游离DNA的水平就会稳定并开始下降，反之如果患者情况恶化并最终导致器官衰竭，游离DNA的水平会持续保存在高点上，最长的可以达到28天。根据创伤的种类和严重程度，游离DNA的水平也不同，所以游离DNA的水平是创伤预后的一个重要指标。这些观察涵盖了多种创伤，包括外科手术、开放性伤口、灼伤、化学烧伤等，这些创伤都看到了游离DNA水平的迅速升高。在2017年的一份综述文章里，人们列举了14个针对创伤ICU的临床研究，共计904名患者，结论是在创伤病例中，高水平的游离DNA和高死亡率是显著相关的【35】。

更多的研究发现，对于创伤导致的肺损伤、呼吸压力症的患者，相对于最终没有引发这些并发症的患者，他们的游离DNA的水平要高12倍【25】。刺穿创伤的患者的游离DNA水平高于钝击创伤的患者，并发感染的患者的游离DNA水平高于比没有感染的患者【26】。在创伤患者的系统里，不仅核源的游离DNA水平升高，线粒体DNA的水平也升高【28】。这些结果也进一步说明，游离DNA和机体应急状态密切相关，和凝血过程密切相关。

4. 游离DNA参与机体防御和凝血

细胞的死亡，无论是正常细胞的凋亡，还是癌细胞的死亡，都会造成游离DNA的量增【35-40】。加上人们对血液凝集过程以及创伤的观察，很自然地推论出游离DNA的来源是细胞死亡造成的。进一步的推论很可能就是，游离DNA只是死亡细胞的释放产物，虽然它有重要的示踪作用，可以帮助鉴别癌细胞、胚胎细胞，但游离DNA是被动的、没有功能的细胞废物，在血样中逐渐减少并消失呢，实际情况是否是这样呢？实际情况总是复杂得多。

根据对血液白细胞和凝血的细致研究，人们发现游离DNA是中性粒胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，简称NET）的重要组成部分【41-51】。 中性粒胞外陷阱是近年来新发现的免疫防御系统，在外来病原体（比如细菌）或是免疫信号的刺激下，中性粒细胞会释放出特殊的网状结构来缠在病原体，防止其扩散和增生。这个网状结构就是中性粒胞外陷阱，是由游离DNA、组蛋白和抗微生物蛋白组成的【41】。没有游离DNA就不会形成中性粒胞外陷阱，如果用DNA酶来降解DNA会导致中性粒胞外陷阱的失活。这在客观上解释了为什么正常人，无论多么健康，都是有一定水平的游离DNA, 因为游离DNA是机体防御的一部分。

对中性粒胞外陷阱的研究还发现，这些网结构可以刺激凝血和血栓的形成【42】。在动物模型里，人为提高游离DNA的水平，可以直接刺激凝血酶-抗血栓酶复合物的发生和增长，表明游离DNA很可能参与了某种凝血刺激信号。在由病原体激活的全血样品中，游离DNA的主要来源是中性粒细胞。中性粒胞外陷阱在形成血栓后导致中性粒细胞死亡，同时释放游离DNA。这个过程不同于通过细胞凋亡来是否游离DNA，因为没有它没有导致DNA长链的断裂【44】。

买球网知道凝血和血栓过程是机体自我保护的一种机制，但同时它在某些病理情况下也是对机体有伤害作用。无论是保护和伤害，游离DNA参与凝血和血栓都说明，游离DNA不只是被动的、没有功能的细胞成分，而是细胞功能的一部分，是细胞的工具并可以被主动调控。至于游离DNA是怎样被调控的，并用怎样的机理来调控血凝和血栓，现在人们的知识还很有限。随着液体活检领域的科研和临床研究的展开，游离DNA在正常生理环境下的身份，一定会更加清晰。

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