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针对具有活性的循环肿瘤细胞的功能性研究

原文出处

Clinical Chemistry 62:2

作者

Klaus Pantel and Catherine Alix-Panabie

作者信息

* Address correspondence to this author at: Laboratory of Rare Human Circulating Cells, Department of Cellular and Tissue Biopathology of Tumors, Institut Universitaire de Recherche Clinique, 641, avenue du Doyen Gaston Giraud, 34093 Montpellier Cedex 5, France. Fax +33-4-11-75-99-33; e-mail c-panabieres@chu-montpellier.fr. Hamburg, Germany; 2 Laboratory of Rare Human Circulating Cells, Department of Cellular and Tissue Biopathology of Tumors, University Medical Centre, Montpellier, France; 3 EA2415—Help for Personalized Decision: Methodological Aspects, University Institute of Clinical Research, Montpellier University, Montpellier, France.

摘要

背景：针对循环肿瘤细胞（CTC）这种新型的生物标志物的研究在过去十年中受到高度关注。特别重要的是，以捕获和分析CTC为特征的液体活检提供了非侵入性的组织活检的可能性，这在癌症诊断中具有明显的意义。

内容：本篇综述的重点是描述和讨论如何对有活性的CTC的功能研究可以扩大液体活检的应用范围，重点是乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌， 这些都是工业化国家的主要癌症。大多数癌症患者的外周血中CTC的数量较少， 这使得CTC的体外培养变得具有挑战性。上皮肿瘤细胞难以培养，甚至在数百万肿瘤细胞开始时也是如此。最近，几个课题组已经在具有较高量的CTC的非常晚期的癌症患者体外和体内扩增CTCs方面取得了重要进展。在这里，买球网提供目前的技术来富集和检测有活性的人类CTC，包括基于抗原表达和物理性质的阳性和阴性富集策略。买球网还讨论了关于使用体外和体内模型的CTC功能研究的公开数据。

结论：对CTC的功能分析提供了识别转移细胞的生物学特性的可能性，包括确定转移起始细胞。此外，从CTC衍生的细胞系和异种移植物可能会揭示新的治疗靶点，可用于药物筛选。

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背景介绍

      在过去十年中的许多研究表明，循环肿瘤细胞（CTC）的计数在各种肿瘤实体中具有预后价值（1,2）。大多数研究涉及到最常见的上皮肿瘤、如乳腺癌、前列腺癌或肺癌; 这些肿瘤类型也是本篇综述的重点。五年前，买球网将CTCs的捕获和分析介绍为“液体活检”（3），这一概念受到了极大的关注。通过简单的血液检查来避免侵入性组织活检和获得相似或甚至增加的信息的可能性在癌症诊断中具有巨大的意义。

      尽管许多新的CTC捕获装置（1）的发展和大量临床研究表明，在具有定义疗法的大型多中心队列研究（4-6）中，CTC计数与临床结果之间存在强相关性，但是有关CTC的功能特性的信息是仍然非常有限，因为CTC在癌症患者的外周血中以非常低的浓度发生（1）。因此，功能分析的先决条件是买球网在体外培养CTC的能力的最近进展，或通过使用异种移植物来用体内扩增的办法来增加CTC的总量。

      在这里，买球网描述如何丰富和检测可行的人类CTC，并通过使用体外和体内模型讨论功能研究。除了解决癌症患者转移生物学外，这些研究可以提供未来的重要临床信息，包括用于癌症患者个性化治疗的抗转移药物的检测。

富集和检测有活性的CTC的策略

      通过增加CTC浓度的浓缩步骤可以更容易地检测单个CTC。为了在浓缩和检测功能性CTC期间使肿瘤细胞处于可行状态，需要（a）在没有固定剂的管中进行抽血，（b）快速（24小时）将血液样品运送到实验室，（c）快速分离和检测透化，（d）在适当的培养条件下。买球网将讨论目前CTC测定在捕获可行CTC的能力方面的潜力和局限性，用于后续分析。

富集有活性CTC的三类方法

1. 基于蛋白质表达的技术。细胞表面蛋白可用于基于抗体的富集步骤以附着CTC。通过使用上皮细胞粘附分子（EpCAM）进行阳性选择，上皮细胞粘附分子（EpCAM）是最常用于上皮CTC阳性富集的细胞表面标记物。鉴于肿瘤细胞经历上皮 - 间质转化的能力，CTC的捕获可能不仅仅依赖于EpCAM表达，而可能需要额外的靶点（例如表皮生长因子受体（EGFR），人表皮生长因子受体2（HER2），粘蛋白1（MUC1）]（7,8）。显然，不能使用细胞内蛋白质，因为细胞必须保持完整。不同的技术已被用于阳性选择，包括免疫磁性分离或基于流式细胞术的细胞分选（7）。如果使用免疫磁性分离，重要的是珠不会损害细胞活力。如果流式细胞分选遵循免疫分离，珠的大小也可能是限制。需要进行高速流分选以实现CTC的快速隔离，并避免细胞活力丧失。

      阳性选择的缺点是，为了选择合适的抗体，必须假设捕获抗原的细胞表面表达。肿瘤异质性是癌症的标志;因此，预测在个体患者中在CTC上表达的合适的捕获抗原的光谱是非常困难的（如果不是不可能的话）。为了规避这个问题，使用相反的策略可能是有吸引力的：通过阴性选择来消除白细胞，通过使用在健康造血细胞而不是癌或其他实体瘤上表达的CD45。阴性选择通常导致CTC的纯度低于阳性选择，但这并不是后续功能研究的严重缺点，因为污染性白细胞通常不会干扰细胞培养或异种移植物测定。阴性选择技术的实例是白细胞的免疫磁性消耗或使用与红细胞和白细胞反应的抗体的复合物，然后把复合物导致通过使用Ficoll梯度离心（9-11）除去。

2. 物理性质的技术。丰富CTC的另一种方法是按照与白细胞不同的物理特性对其进行排序：实际上，肿瘤细胞最初被认为比白细胞更大，更不易变形。然而，最近的CTC研究表明存在小的CTC，甚至可能导致转移进展（12）。

郑等人报道了可以丰富可行CTC的新型三维（3D）微型过滤器装置（13）。该装置由2层具有孔隙的Parylene膜和用光刻精确定义的间隙组成。

孔的位置在顶部和底部膜之间移动。底部膜支持捕获的细胞，使细胞膜上的应力集中最小化，并在过滤期间维持细胞活力。通过扫描电子显微镜，共聚焦显微镜和免疫荧光染色，通过使用掺入血液或盐水的培养肿瘤细胞的模型系统研究该装置的活细胞捕获。

      最近，Zhou等提出了一种可分离的双层（SB）微型过滤器，用于可行的基于尺寸的CTC捕获（14）。与其他单层CTC微型过滤器不同，2层之间的精确间隙和孔对准的结构导致CTC的机械应力急剧下降。随着多种癌细胞株在健康供体血液中的掺入，SB微滤膜显示出高捕获效率（78％-83％），细胞活力保留率高（71％-74％），高肿瘤细胞富集（1.7-2103）和广泛的建立培养文化的能力（100％的细胞系测试）。在转移性小鼠模型中，SB微滤器成功地从0.4-0.6mL全血中富集可行的小鼠CTC，并允许建立体外培养用于进一步的遗传和功能分析。

      Harouaka等设计了一种灵活的微弹性阵列装置，用于富集活的CTC，与抗原表达无关（15）。与以前的微量过滤装置不同，微量元件的柔性结构使细胞损伤最小化，以保持生存力，同时最大限度地提高生产量，并允许直接从全血中快速富集，无需样品预处理。 CTC和CTC微团簇从从乳腺癌，肺癌和结肠直肠癌患者获得的临床样品中富集。该装置在0.5-cm 2装置上在10分钟内从7.5mL全血样品中富集90％捕获效率，104倍富集和80％存活力的肿瘤细胞。

      独立于富集方法，对于随后的功能测定，细胞既不是固定的也不是透化的，并且它们可以容易地从装置中去除而没有任何损害是至关重要的。

3. 基于CTC功能的技术。 CTC的功能特性也可用于其富集。大约10年前描述了第一个测定法，并且基于肿瘤细胞在体外侵入胶原基质的能力。该测定已被用于卵巢和前列腺癌中CTC的计数和分子表征（16,17），但据买球网所知，其培养CTC的效率仍有待证明。

最近，King和同事探讨了肿瘤细胞粘附于血管以捕获CTC的机制（18,19）。他们开发了微量流量装置，除了具有抗上皮标记的抗体外，还包括用E-选择素糖蛋白功能化的表面。该装置已成功用于从转移性癌症患者的血液中捕获癌细胞。分离后，将培养的细胞保持15天。同一组描述了在不存在EpCAM捕获抗体（20）的情况下支持选择素介导的活性CTC捕获的固定表面活性剂 - 纳米管复合物，其允许经历上皮 - 间质转化的CTC的EpCAM非依赖性捕获。

检测有活性CTC的方法

      许多研究表明癌症患者可以同时存在凋亡和活的CTC（1）。因为只有可行的CTC可以有助于转移进展，因此识别CTC的这个子集是很重要的。一种方法是将细胞凋亡标记（M30Bcl-2）引入免疫CTC测定，如CellSearch系统（21,22）。令人惊讶的是，在CTC数量较多的患者中，较高的CTC细胞凋亡率与较差的预后相关，而较高的CTC Bcl-2浓度与更好的预后相关（22）。因此，将凋亡标记物引入CTC检测的临床相关性仍在调查之中。

      另一种方法是使用CTC活力的功能测定。据买球网所知，在数百名不同肿瘤类型的患者中使用的唯一现有的功能测试是EPISPOT，其允许检测白细胞消耗富集的活的临床相关CTC（23,24）。该技术能够检测EpCAM和EpCAM CTC。将细胞在包被有捕获分泌/释放/脱落的肿瘤相关蛋白的抗体的膜上培养短时间，随后用荧光染料标记的二次抗体检测。对于乳腺癌，细胞角蛋白19（CK19），HER2，组织蛋白酶D和MUC-1已被用作标记蛋白，相关的临床资料表明CK19释放细胞的患者有不利的结果（24,25）。对于前列腺癌，前列腺特异性抗原已被用于CTC检测和成纤维细胞生长因子2作为干细胞生长因子用于进一步表征（26）。对于结肠癌，CK19已被用于CTC检测（23），买球网的分析表明，EPISPOT可检测的相当大部分活性CTC作为结肠癌患者的第一个滤器器官被捕获在肝脏中。买球网的临床资料表明，局限性结肠癌患者和大量CTC是和不良的预后结果匹配的。在EPISPOT测定中，当肿瘤细胞对这些药物敏感时，免疫球蛋白的数量和强度可以降低或抑制，证明其在短时间CTC培养中的效率（27）。该项检测可能被认为是一种“癌症编排程序”，可能有助于改善个体癌症患者的临床管理。

CTC的体外培养：细胞系的建立

      大多数癌症患者的外周血中CTC的数量较少使得CTC的体外培养变得具有挑战性。几十年来，即使从数百万肿瘤细胞开始，开发初级肿瘤或癌症患者转移的原代细胞培养物或细胞系也是一个挑战。最近，几个组织已经为CTCs获得的CTC提供了适当的培养条件，这些CTCs在具有较高CTC数量的非常晚期的癌症患者中获得。接下来，买球网讨论这些发展。

      结肠癌。Cayrefourcq et al的团队提供了从结肠癌患者的血液中分离的CTC能够产生永久性细胞系的实验证据（9）。据买球网所知，没有其他组织已经公布了建立永久性细胞CTC系或甚至结肠癌患者的瞬时CTC培养物。一个原因是结肠癌患者的外周血与乳腺癌或前列腺癌患者的CTC频率较低，使得在结肠癌中发现和生长CTC更加困难。

       除了建立永久性细胞系外，买球网还证明，该细胞系在免疫缺陷小鼠中具有致瘤性。

       除了体外扩增2年的能力之外，CTC-MCC-41系显示（a）具有干细胞样特征的上皮性质，（b）中间上皮/间质表型，（c）快速诱导体外血管生成的潜力，（d）骨模拟征象，和（5）SCID小鼠的致瘤性质。重要的是，本CTC系列共有原发肿瘤和结肠癌患者淋巴结转移的主要特征。

       前列腺癌。前列腺癌在细胞培养中非常难扩展，如生物库中可用的少数细胞系所证明的。高等使用3D组织系统从活检标本和CTC（28）开发前列腺癌的长期培养。前7个完全表征的有机体系概括了前列腺癌亚型的分子多样性，包括TMPRSS2-ERG融合，SPOP突变，SPINK1过表达和CHD1损失。作者建立了转移性前列腺癌患者的CTC系;该报告没有提供关于建立CTC系列成功率的任何信息，例如培养条件未能产生初级CTC培养物或细胞系的次数。此外，作者尚未在异种移植模型中证实其细胞系的致瘤性质。

      乳腺癌。Zhang et al。报道了第一次建立起晚期乳腺癌患者的CTC的初级培养物，并提供脑转移瘤（7）。然而，CTC不产生永久性细胞系，而是仅产生瞬时细胞培养物。在EpCAM CTCs中，Zhang et al团队确定了包括“脑转移选择标记”（BMSM），HER2 / EGFR / HPSE / Notch1（7）的脑转移的潜在特征。表达BMSM特征的CTC线是高度侵袭性的，并且能够在裸鼠中异种移植时产生脑和肺转移。

      关于乳腺癌CTC培养物的下一篇出版物报道了从6名转移性乳腺癌 - 亚型乳腺癌患者中分离的CTC的寡克隆CTC培养物（体外持续6个月）（29）。测试的5个CTC线中有3个在小鼠中是致瘤性的。 CTC系的基因组测序揭示了PIK3CA（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚单位）中预先存在的突变和ESR1（雌激素受体1），PIK3CA和FGFR2（成纤维细胞生长因子受体2）中新获得的突变，其他。具有多个突变的CTC系药物敏感性检测显示出潜在的新治疗靶点。

      肺癌。Zhang et al的团队开发了一种新型的原位捕获和培养方法，用三维共培养模型离体扩增CTC，模拟肿瘤微环境以支持肿瘤发育（30）。他们扩大了从19名早期肺癌患者中的14名中分离出来的CTC。扩大的肺CTC携带与匹配的原发性肿瘤中观察到的相似的TP53突变（肿瘤蛋白p53）。下一代测序进一步揭示原发性肿瘤与癌症相关基因的CTC之间的其他匹配突变。

CTC的体内扩增：用新鲜的CTC来培养异种移植物

      在这里买球网将讨论没有建立细胞培养物或细胞系的研究，买球网将来自乳腺、前列腺和肺癌患者的血液的CTC部分富集直接注射到免疫缺陷小鼠中。异种移植前的细胞培养可能会影响CTC的组成; 然而，迄今为止没有报道从新鲜分离的和培养的CTCs开发的异种移植物之间的直接比较。

      乳腺癌。Baccelli et al。开发了异种移植物测定法，并用它来表明原发性人乳腺癌乳腺癌CTC含有在小鼠中产生骨，肺和肝转移的细胞（11）。这些CTC子集表达EpCAM，CD44，CD47和MET。在一小群转移患者中，EpCAM CD44CD47MET CTC的数量，但不是所有的EpCAM的CTCs与较低的总生存期和增加的转移部位数相关。该报告可能意味着具有潜在转移起始活性的CTC的特殊子集; 然而，应该注意的是，仅在高CTC计数的晚期阶段患者中观察到成功的异种移植。事实上，注射1000只CellSearch评估的CTCs在移植后15个月内（n = 106）没有导致人类肿瘤细胞的转移生长。相比之下，接受1109 CTC的6只受体小鼠在3例患者移植CTC后6-12个月内发生多发性骨，肺和肝转移。

       在2例乳腺癌患者的小型试验研究中，Rossi等证实了CTC具有在免疫缺陷（NOD / SCID）小鼠中生长的潜力（31）。与Baccelli等人相反。 （11），他们向胫骨注射了CTC，Rossi等人皮下注射CTC。因此，反恐委员会维持其迁徙能力，两种注射途径似乎都适用于在乳腺癌中建立CTC异种移植物。

肺癌。大多数小细胞肺癌（SCLC）病例是不能手术的，很少可以获得SCLC生物学检查活检。以前的研究表明，所有实体肿瘤患者中CLC患者的CTC计数最高，为开发功能模型提供了最佳条件（32）。 Hodgkinson等人表明来自化疗敏感性或化疗性SCLC患者的CTC在免疫受损的小鼠中是致瘤性的，并且所得到的CTC衍生的外植体（CDX）反映了放射性淋巴细胞反应性和代谢性化疗（10）。分离的CTC的基因组分析显示与相应的CDX相当相似。来自不同临床结果的患者的CDXs之间观察到最明显的差异。

      前列腺癌。Rossi等人来自转移性前列腺癌患者（n6）的分离的EpCAM CTC，在NOD / SCID小鼠中开发异种移植物测定（31）。在小鼠外周血，骨髓和脾脏中发现人类肿瘤细胞，这表明CTC的EpCAM阳性部分保留迁移能力。

结论

      细胞培养技术的最新进展为CTC研究开辟了新的途径，具有明显的临床意义。现在可以开发来自CTC的原代细胞培养物，在某些情况下，甚至已经建立了永久细胞系。除了体外研究之外，几组已经能够在注射到免疫缺陷小鼠后移植肿瘤，而第一次测试分析表明，这些模型可能是癌症患者反应的有用预测因子（图1）（33）。

      需要强调的是，反恐委员会的功能分析仍处于早期的原则证明。大多数报告是基于晚期转移期和高CTC计数的患者。然而，考虑到从数百万个原发性肿瘤细胞建立细胞系的巨大挑战，开始时，数百个CTC的细胞系或异种移植物的发展是一个主要的成就。这可以通过以下假设来解释：可能已经选择了可行的CTC来获得更好的存活和生长特性，这与已发表的报道一致，证明肿瘤细胞的传播和弥散性肿瘤细胞和CTC的存活不是随机过程（34,35）并且CTC细胞系和异种移植物表达癌症干细胞性质（9,11）。这些研究滋养了对CTC的深入功能分析可能导致转移诱导细胞的鉴定的希望。然而，为了实现这一重要目标，至关重要的是将现有研究扩展到早期阶段的患者，并将结果与转移性复发的发展相关联。

      最近，液体活检概念已经扩展到循环的无细胞肿瘤DNA（ctDNA）（36）。买球网相信，CTC和ctDNA的分析提供了不同的分析机会，因此提供了补充信息（37）。从数百万个血细胞捕获活的CTC当然比从血浆或血清样品中获得无细胞循环DNA更费时。然而，整个肿瘤细胞的功能分析提供了通过深入的体外和体内分析来鉴定转移细胞的生物学特性的可能性，这为基础和翻译研究开辟了新的途径，远远超出血浆中存在的片段DNA的测序。