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原文出处

The Oncologist 2016; 21:1121-1130

作者

BENJAMIN LEVY,^a ZISHUO I. HU,^a,* KRISTEN N. CORDOVA,^b SANDRA CLOSE,^c KAREN LEE,^a DANIEL BECKER^d,*

作者所属机构

^aIcahn School of Medicine, Mount Sinai Health System, New York, New York, USA; ^bOncology Resource Group, San Francisco, California, USA; ^cGenEngine Group, Carlsbad, California, USA; ^dVeterans Affairs Hospital, New York University, New York, New York, USA Disclosures of potential conflicts of interest may be found at the end of this article. *Contributed equally.

关键字

非小细胞肺癌，液体诊断，无细胞DNA ，循环肿瘤细胞，微型RNA

摘要

在近年来，买球网对肺癌基因组图谱的深入理解使非小细胞肺癌 (NSCLC) 的靶向治疗得到了长足进展。从历史上来说, 肺癌晚期患者的诊断及基因鉴定参考标准物通常为在计算机体层摄影 (CT) 引导下粗针/细针穿刺活检获取的组织。然而, 这一步骤常使患者处于危险之中, 且结果也可能因样本可用性及肿瘤异质性的差异而较为混杂。此外, 完成这一诊断检验需要一定的时间, 这可能对临床治疗造成不利的影响。近年来临床技术的进展引领了基于血液的诊断学 (或称“液体活检”) 的飞速发展, 从而使应用微创技术对肺癌进行快速诊断和基因分型成为可能。最近有研究提示从无细胞DNA (cfDNA) 或循环肿瘤细胞中发现的分子学突变可以作为肿瘤活检的一项精准分子指标, 进而能可靠地预测患者对酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 治疗的反应。另外, 多项研究均证实microRNA (miRNA) 平台在高危筛查患者中鉴别恶性与良性结节时具有高准确性。尽管这些平台的前景令人瞩目, 但目前尚有许多问题, 包括各竞争平台之间敏感性和特异性的差异, 以及技术和下游操作程序缺乏规范化标准等。本文回顾总结了液体活检技术在NSCLC中的临床应用, 包括循环肿瘤细胞、蛋白质组学、miRNA及cfDNA等, 并对这些平台在诊断和治疗上的临床意义及面临的挑战提出了展望。

对临床实践的提示

肿瘤活检是非小细胞肺癌诊断和基因分型的参考标准, 但其肿瘤活检的流程复杂, 可能延误治疗决策并影响临床治疗。液体活检平台，包括无细胞 DNA、蛋白质组学信号、RNA (mRNA 和 miRNA) 及循环肿瘤细胞， 有潜力克服这些障碍, 如快速并准确鉴定新发及耐药基因突变、实时监测治疗应答、预测患者转归并发现微小残留病灶等。本文对非小细胞肺癌的新型液体诊断平台提出了展望, 并讨论了当前和将来临床应用的前景和挑战。

前言

肺癌一直是死亡率最高的癌症之一，所有阶段都考虑进去，肺癌的5年存活率仅为17％[1]。尽管靶向治疗的发展和新型免疫治疗方法的出现取得了进展，但非小细胞肺癌（NSCLC）的诊断和治疗仍然存在重大挑战。首先，虽然采用低剂量螺旋CT计算机断层扫描（LDCT）筛查高危患者可能允许早期检测，但大约65％的患者仍然存在晚期疾病，1年以上死亡半数以上[1]。此外，对于接受治疗意向治疗的患者，目前，常规成像以外的任何策略都不可用于检测复发或最小残留疾病。最后，标准的肿瘤活组织检查可能是麻烦的，使患者处于危险之中，并且由于不理想的组织获取和肿瘤异质性，可能无法准确识别相关的分子改变。鉴于这些挑战，迫切需要其他策略来帮助诊断有选择分子驱动疗法的患者的NSCLC和基因型肿瘤组织。

最近的技术进步导致NSCLC中基于血液的诊断或“液体活检”的发展。这种非侵入性方法允许早期检测从头或复发性疾病，结果的预后，识别引导靶向治疗的遗传改变以及治疗反应的实时监测。虽然液体活组织检查物历史上是指循环肿瘤细胞（CTC），但是定义已经扩展到包括蛋白质组学，微小RNA（miRNA），信使RNA（mRNA）以及最近的无细胞DNA（cfDNA）。买球网回顾了NSCLC中液体活检的技术，并讨论了这些平台的诊断和治疗意义。   

表1.鉴定遗传改变的诊断方法

CFDNA

在1948年首先被Mandel和Metais发现，碎片DNA或cfDNA已经与许多病症有关，包括终末期肾病，心肌梗塞，中风和创伤[2-7]。多项研究已经显示了cfDNA水平与细胞损伤和坏死程度之间的相关性，与癌细胞存活和繁殖相关的过程。随着肿瘤体积的增加，可以超过吞噬细胞消除和清除凋亡和坏死片段的能力，导致cfDNA被驱动释放到血液中[8]。或者，体外研究表明DNA可以通过活性机制释放，其中癌细胞自发释放DNA片段进入循环[9]。根据肿瘤大小和血管分布，循环中释放的cfDNA的量可以在血浆中存在的所有DNA的0.01％至90％之间变化[10]。与早期疾病相比，多项研究报道，与健康对照组相比，肺癌患者的cfDNA升高与晚期疾病相比增加了cfDNA浓度[11,12]。最近的基因组技术（包括数字聚合酶链反应[D-PCR]，扩增耐受突变系统[ARMS]，珠粒，乳液，扩增和磁性[BEAMing]，标签扩增子深测序和下一代测序[NGS]）可以检测血浆或血清中的低水平的cfDNA，并鉴定相关的遗传改变（表1）。调查人员最近不仅使用cfDNA来识别具有可行突变的患者，包括致敏（外显子19和21）和抗性（T790M）EGFR突变，而且还作为对酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的药效学反应的实时监测。

表2.评估NSCLC患者的cfDNA EGFR突变的研究

确定治疗原始患者的突变：与组织活检一致

基于血液的基因分型的一个关键问题是cfDNA是否可以作为EGFR突变鉴定中相应组织的准确分子代谢。 Kimura等人匹配的肿瘤和血清样品衍生自用吉非替尼治疗的42例晚期NSCLC患者[13]。在血清和组织中鉴定的EGFR突变之间的一致率为92.9％（在42个配对样品中的39个中匹配），灵敏度为85.7％。在晚期NSCLC患者中，IV期单臂测试用例一线吉非替尼的一组患者中，高度一致率也有所差异[14]。治疗前652匹配肿瘤和血浆样本之间突变一致率为94.3％（95％置信区间[CI]，92.3-96.0），敏感度为65.7％（95％CI，55.8-74.7），特异性为99.8％ （95％CI，99.0-100.0）。报告血浆/血清和组织EGFR突变一致性的附加研究评估（表2）报道了跨度很宽的一致性数据（27.5％-100％），但是具有恒定的高特异性（71.4％-100％）。敏感性的差异与采用不同技术非常相关。评估cfDNA EGFR突变诊断标准的多元分析分别为61％和67.4％，特异度分别为90％和93.5％[15,16]。

通过NGS对cfDNA的遗传询问显示超出EGFR的额外突变。在一项研究中，等位基因NGS基因分型为11例患者中的8例，准确鉴定了两个ALK重排，一个ROS1重排，一个RET重排，一个EGFR G719A突变，一个KRAS G12C和一个组合的KRAS G12C / PIK3CA [17]。在第二项研究中，54例使用血浆NGS评估的患者中有42例具有至少一个可识别的反应，7例连接到U.S。食品和药物管理局批准的药物和17资格获得针对另一种疾病类型的靶向治疗[18]。最后，使用具有捕获点突变，插入/缺失，融合和扩增能力的基于等离子体的数字NGS平台，Mack等人回顾性分析了978例晚期NSCLC患者，并确定了412例患者（42％）中的可行突变[19]。其中包括激活EGFR突变（n5 116），ALK融合（n5 6），RET融合（n5 9），HER2外显子20插入（n 5 9），BRAF突变（n5 26），MET外显子14跳跃突变（n5 8），met扩增（n5 18），EGFR外显子20插入（n5 7）和KRAS / NF1 / MEK突变n5 213）。虽然现在没有获得组织样本来做一致率的研究，但这项技术仍然有希望。

由cfDNA识别的EGFR突变的预测和预后效用

cfDNA的临床前景植根于其作为靶向治疗的预测生物标志物的能力。在上述IV期吉非替尼研究中，EGFR突变阳性cfDNA患者无论突变亚型如何，与组织EGFR突变阳性肿瘤患者的总反应率（ORR）相似（分别为76.9％和69.8％），提示基于血液的EGFR检测可能与组织TKI治疗有关[14]。血浆和组织中突变的匹配样本患者的ORR更高（76.9％; 95％CI，65.4-85.5）与仅有突变阳性肿瘤组织的患者相比（59.5％; 95％CI，43.5-73.7）。相比之下，在针对EGFR突变的1217例初治患者中，吉非替尼与卡铂 - 紫杉醇比较，亚历山大研究（IPASS）233例患者的探索性分析显示了类似的结果[20]。在194例提供预处理血清样本的患者中，46例（23.7％）具有蝎型ARMS鉴定的cfDNA EGFR突变。虽然吉非替尼（n524）与化疗相比（n522）治疗的患者的ORR改善并不显着（ORR，75％对64％; p5.40），但无进展生存期（PFS）有统计学意义的改善）（危险比[HR]，0.29; 95％CI，0.14-0.60; p，.001）。 cfDNA EGFR突变状态和治疗之间的显着相互作用对于PFS是显而易见的（相互作用测试，p.5045）。多个其他研究已经证明了在cfDNA中鉴定的EGFR突变是TKI治疗的可靠预测生物标志物[13,21-25]。

最近的研究也证实了在TKI治疗期间不同时间点的cfDNA中EGFR突变的定量变化的预测价值。 Tseng等前瞻性评估了62例晚期EGFR阳性患者接受吉非替尼血清和组织样本的匹配[26]。使用肽核酸 - 拉链核酸PCR钳夹方法在10周时评估cfDNA，并对疾病进展进行评估，研究表明，不能清除血浆EGFR突变是疾病控制率较低的独立预测因子（优势比[OR] 5.26; 95％CI，1.13-24.44; p5.034），较短的PFS（HR，1.97; 95％CI，1.33-2.91; p5.01001）和总生存率（OS; HR，1.82; 95％CI， 1.04-3.18; p5.036）。 Mok等人使用cobas测试（Roche Molecular Diagnostics，Pleasanton，CA，http：// www。molecular.roche.com）评估患者的III期临床研究中的血清/血浆EGFR突变，随机分为六个周期的吉西他滨/铂加顺序厄洛替尼或安慰剂[25]。对于在基线时通过cfDNA进行EGFR阳性治疗的患者，与符合cfDNA持续性的患者相比，cfDNAatcycle3的消失相关性显着改善PFS（HR，0.38; p 5 .0083）和较长的OS（HR，0.45; p.5 .0831） EGFR。最近，Marchetti等在TKI治疗前进行了具有已知组织和血浆EGFR突变的晚期患者（n5 20）的系列血浆样品的PCR和超深层NGS。 14天时血浆EGFR拷贝数减少50％的患者（快速反应者; n5 14）与没有达到这种变化的缓慢反应者（n5 6）相比具有更大的肿瘤缩小平均百分比（70％vs 30％; p，.0001）[27]。最后，Newman等人使用深度测序方法（通过深度测序进行的癌症个性化分析）来量化癌症特异性基因组变异。能够证明从接受化学疗法或靶向治疗的晚期阶段患者（n5 3）的纵向样本中分离的血浆ctDNA水平与治疗期间的肿瘤体积高度相关[28]。 Insum，在这些研究中治疗期间，突变的实时药效学监测，最显着的EGFR突出了该平台作为对治疗的反应或抗药性的早期预测因子的潜力，可以为治疗决定提供信息。

西班牙肺癌组已经对西班牙肺癌组进行了研究，预测厄洛替尼与标准化疗的预后分析作为欧洲先进EGFR突变阳性非小细胞肺癌患者（EURTAC）的一线治疗。研究76例可识别的cfDNA EGFR突变患者[29]。使用TaqMan测定评估cfDNA中EGFR突变的亚型，研究表明L858R突变患者的中位OS比外显子19缺失（13.7个月; 95％CI，7.1-17.7;对30.0个月; 95％CI，19.3-37.7; p，.001）。在组织中的41例L858R突变患者中，在cfDNA中也检测到L858R突变的患者的中位生存期显着缩短，在cfDNA中没有检测到突变（13.7对27.7个月; HR，2.22; p5 .03），提示了血浆cfDNA的 L858R突变的预后价值。

T790M在TKI耐药患者和初次治疗患者中的鉴定

几项研究已经确定了TKI-naive和耐药患者的cfDNA中的抗T790M突变。 Kuang等通过ARMS和/或WAVE / Surveyor方法检测EGFR T790M在来自对EGFR TKI的先前临床反应的28位患者中的15名，但仅有14名之前的患者具有先前的稳定性疾病。血浆DNA中检测到的EGFR T790M突变与先前对TKI的临床反应密切相关（p = .004）[30]。最近，等离子体BEAMing用于评估罗西利滨组的I / II期临床试验，TKI选择性靶向EGFR-阳性，晚期NSCLC患者的活化和T790M EGFR突变，其在EGFR导向治疗期间经历疾病进展[31 ]。以组织为参照标准，血浆T790M的一致性百分比为81％（195）。尽管血浆阳性和组织阳性T790M患者罗昔瑞尼的未确认反应率为53％，但所有血浆阳性患者对T790M均为组织阳性。在具有血浆或组织阳性T790M病变的患者中，已经证明了另外第三代TKI的奥西替尼也有类似的结果。最后，使用与NGS结合的PCR方法，Husain et al。在22例EGFR阳性患者（68％）接受TKI治疗的15例中鉴定出T790M突变。在15例T790M阳性患者中，10例患者在组织活检中发生T790M突变，使用“临床实验室改进修正”[32]。

在初治患者中也已经临床检测到了cfDNA中的T790M鉴定，并用于监测实时反应。 Wang等评估135例晚期NSCLC患者，临床获益为6个月以上（PFS.6个月），采用一线或二线TKI治疗，并回顾性分析了TKI匹配前后TKI的EGFR敏化突变和T790M突变血浆通过多重测定，包括D-PCR [33]。在83例组织已知EGFR突变患者的队列中，根据D-PCR前TKI血浆样品中T790M的数量，将患者细分为3组（高，0.5％，n57;低，0％ - 5％，n5 20;零，0％，n5 56）。中位PFS分别为7.1、9.5和12.8个月（P = 0.001001），中，高分别为低值组和低氧组，平均OS为18.2,21.2和32.5个月（p5.005），表明高处理T790M突变负荷可能定义患者不太可能受益于TKI治疗。 Sorensen等使用等位基因特异性PCR来鉴定23例接受二线TKI治疗的晚期腺癌患者血浆中敏化和耐药EGFR突变，作为大型临床试验的一部分 [34]。在治疗期间的多个时间点评估cfDNA，并且在使用实体肿瘤中的响应评估标准之前，在疾病进展前344天的9名患者中显示T790M突变，说明在常规成像之前鉴定抗性疾病的潜力。在Wang等人的上述两项研究中和Sorenson等人，T790M没有在组织样品中询问;因此，无法确定一致率。在TKI治疗前，从头开始还是临床进展之前，血浆或组织T790M的鉴别是否应该引导T790M导向治疗的治疗决定。

 

蛋白质

 

已经研究了许多源自肿瘤和肿瘤微环境的蛋白质作为NSCLC的生物标志物。历史上，蛋白质生物标志物包括癌胚抗原，细胞角蛋白-19片段和鳞状细胞癌抗原。尽管几项研究已经证明了这些标志物的预后和预测价值，但由于其相对较低的灵敏度和特异性，它们在肺癌检测中的应用普遍具有有限的临床应用或作为反应的替代。最近，已经使用质谱法（例如，基质辅助激光解吸电离）分类器来鉴定蛋白质组学特征。这些签名是一种算法的基础，该算法已经导致了商业化测试，将高级阶段患者与参考组相比分为“差”或“良好”组。这项测试既有预后和预后能力，也可以使用多西紫杉醇或厄洛替尼接受二线治疗的晚期NSCLC患者[35]。几项研究也突显了该平台在接受一线治疗的晚期NSCLC患者中的预后效果，独立于其他常见的预后因素[35-38]。

 

表 3. 报告循环miRNA作为NSCLC生物标志物的研究

mRNA和miRNA

 

miRNA是预测在人类基因组中调节10％-30％的蛋白质编码基因的小型非编码RNA。已被证明在肿瘤起始，入侵和转移中起重要作用[39]。循环miRNA由于其使用定量逆转录PCR（qRT-PCR）的稳定性和定量性而被认为是有吸引力的癌症生物标志物[40]（表3）。对于NSCLC，循环miRNA已被调查其在诊断，预后价值和对治疗的预测应答方面的潜力。已经为NSCLC鉴定了许多miRNA特征谱。

 

肺癌诊断与筛查

多项研究报道了miRNA对NSCLC诊断的潜在应用。 Shen et al。确定了与健康个体相比，NSCLC患者（n = 5，58），血浆中的四个miRNA（miRNA-21，miRNA-126，miRNA-210和miRNA-486-5p）的一组显着升高具有86％的敏感性和97％的特异性[41]。在探索性I / II期生物标志物研究中，Hennessey et al。鉴定了能够区分NSCLC（n5 55）和无癌患者（n 5 75）的miRNA对（miRNA-15b和miRNA-27b），特异性为84％（95％CI，0.73-0.91），灵敏度为100 ％（95％CI，0.93-1.0）[42]。 Leidinger等使用qRT-PCR分析来鉴定一组能够从健康对照（n5 20）分离肺癌患者（n = 5 74）的五种标志物，特异性为98％（95％CI，0.95-1.0），灵敏度为91％（95％CI，0.87-0.94）[43]。此外，他们能够区分NSCLC患者（n = 5 74）与慢性阻塞性肺疾病患者（n5 26），特异性为81％，灵敏度为86％，使用10个miRNA标记。

 

现在人们也已经使用miRNA筛选具有发展NSCLC风险的个体。在鉴定出一组与NSCLC患者血清差异表达的10种miRNA与无癌症对照相比较后，Chen等使用miRNA集回顾性分析了7例NSCLC患者在诊断前后的血清样本[44]。他们发现他们的miRNA谱可以在临床诊断前33个月内鉴定癌症。 Boeri等人鉴定了两种不同的螺旋CT筛选试验患者中与肺癌相关的特异性血浆miRNA特征[45]。然后，miRNA特征分类器（MSC）算法在多中心意大利肺部检测中有效地评估了939个等位基因（69例肺癌和870例） （MILD）临床试验比较LDCT（n5 652）和观察（n5 287）[46] .MSCs的灵敏度为87％，特异度为81％; LDCT灵敏度为79％，特异度为81％。一起使用MSC和LDCT导致LDCT假阳性率降低了五倍（从19.4％降至3.7％）。研究人员计算，使用两个测试可以将筛选灵敏度提高到98％[46]。 Bianchi等比较93例患者在鼻咽癌患者中的血清样本与非癌症患者的血清样本的NSCLC诊断相关性研究[47]。他们发现可以区分具有早期肺癌（n534）的无症状高危个体的34 miRNA识别无癌症（n = 30），灵敏度为71％，特异性为90％。评估13名患者在发展肺癌之前和之后，研究者还应用了基于miRNA特征的风险预测算法，其在疾病发病后血清中的风险指数显着增加（p.001，配对t检验） 。

 

治疗预后和预测反应

使用全基因组测序，Hu et al。发现存活超过30个月的肺癌患者的血清中，11个miRNA被改变超过5倍，而存活时间少于25个月[48]。在11种miRNA中，4（miR-486，miR-30d，miR-1和miR-499）与总体存活显着相关。携带两种或更多种高风险miRNA的患者与一种或不具有高危miRNA的患者相比，具有显着增加的癌症死亡风险（log-ranktest，p.0001; HR，3.14; 95％CI，1.65-5.97，对于两种高风险miRNA载体; HR，16.52; 95％CI，8.62-31.68，用于三种高风险miRNA载体; HR，34.13; 95％CI，16.28-71.56，用于四种高风险miRNA载体）。据报道miR-155和miR-197水平在肺癌转移患者中较高（p.05），并且在化疗反应良好的患者中显着降低（p = .001）[49]。

除miRNA之外，还在早期和晚期肺癌患者中评估了信使RNA（mRNA）。癌症/睾丸抗原（CTAs）是通常在睾丸中表达但通常在肺癌中表达的蛋白质抗原。 Gumireddy等采用巢式PCR检测法确定NSCLC肺癌患者外周血单个核细胞中116 CTA基因的mRNA水平与吸烟相关性良性疾病患者差异表达[50]。一个基因AKAP4的表达能够区分NSCLC患者（n5 264）和良性疾病个体（n5 135），以及具有良性结节的患者，面积为0.9714（95％CI， 0.956-0.986）和0.9825（95％CI，0.969-0.995）。与cfDNA相似，研究人员发现AKAP4与癌症阶段相比增加，IV期NSCLC患者的AKAP4 mRNA表达水平比I期NSCLC患者高3,254倍。 AKAP4 mRNA表达与烟草使用没有显着关联，这可能使AKAP4被用作吸烟者和非吸烟者的筛选工具。

 

CTCs

 

CTC是肿瘤细胞通过实体肿瘤流入血液。他们非常罕见，在109例转移性疾病患者中，每109例血细胞中只有少量血液细胞[51]。已经开发了许多方法来检测CTC，包括CellSearch系统（Janssen Diagnostics，Raritan，NJ，http：//www.janssen.com），智能系统仿真技术（ISET）系统（Aligent Technologies，Santa Clara， CA，http://www.aligent.com），流式细胞术，激光扫描细胞计数，基于PCR的方法和CTC微芯片技术[52-55]。在CTC分离后，DNA可以与cfDNA相同的方式进行提取和分析，其显示EGFR突变[56,57]，ALK重排[58,59]和ROS1重排[60]。尽管已经在高达85％的小细胞肺癌患者中鉴定了四氯化碳，但使用上皮细胞粘附分子（EpCAM）的方法报道的NSCLC检测率已经显著降低[61]。鉴于只有NSCLC CTC的亚群患有上皮 - 间质转化和下调表皮生长因子，使用基于EpCAM的方法的检测率较低。虽然使用基于非ePCAM的方法报道了更高的CTC检测率，但是在独立和大型多中心研究中，这些方法需要进一步验证。

 

治疗预后和预测反应

已经证明CTC在转移性NSCLC中具有预后意义[62,63]。使用ISET，Hofman et al。从208名NSCLC患者中分离出CTC，发现一个0.50的临界值对应于较短的OS和PFS。在全球meta分析中，不同阶段肺癌患者预处理CTC的出现与淋巴结状态，远处转移和TNM分期相关[64]。纵向CTC监测也显示，CTC超过一次点阳性的患者生存率比CTC阳性或CTC阴性或持续阴性者的生存率差[65]。

 

EGFR突变和疾病监测的存在

Breitenbuecher等人使用组合的RT-PCR和融合曲线分析显示，EGFR突变体CTC的增加可能是疾病复发和EGFR-TKI抗性的指标[56]。另外，与cfDNA一样，CTC中的T790M鉴定已被用于TKI抗性患者，并监测实时反应。在用EGFR-TKI治疗的NSCLC患者中，Maheswaran等在14例患者（64％）中有9例发现CTCs中有T790M突变，临床进展，突变存在与PFS降低相关（7.7个月对16.5个月; p .001）[57]。

讨论

尽管NSCLC近期取得了治疗进展，但仍然存在严重的诊断挑战，可能会导致治疗决定瓶颈，并对临床护理产生负面影响。买球网审查的液体诊断平台有可能克服许多障碍。也许最大的临床效果是常规使用cfDNA来识别晚期疾病患者（即血浆基因分型）的从头和抗性基因改变。肿瘤活检的局限性最近得到了一项研究的支持，这项研究表明，尽管对组织进行了机构反射测试政策，但在社区学术中心的患者中，高达30％的患者没有接受推荐的分子检测指南[66]。此外，重复组织采集对临床试验注册构成障碍，正如最近一项研究回顾性评估在加拿大单一机构的55例临床试验中的患者入选情况所证实的，其中较少的患者接受了试验强制组织标本的试验治疗，而不是没有（55％vs. 83％; p，.001）[67]。血浆cfDNA平台通过快速基因分型治疗初治难治性患者提供了克服这些挑战的希望，并且可能最终消除了许多临床试验所要求的重复活组织检查的需要。

 

除了血浆基因分型外，液体平台还具有改善第一次癌症和复发风险高患者筛查的巨大潜力。在常规成像之前或结合常规成像鉴定早期或最小残留病的目标仍然是一个挑战。尽管美国国家肺癌筛查试验（NLST）显示LDCT扫描肺癌死亡率降低了20％，但这种模式的高假阳性率值得进一步增强。 mRNA和miRNA平台在恶性结节描绘良性中的准确性是有希望的，具有提高筛选技术的灵敏度和特异性的潜力。治疗意向治疗后，这些平台也有助于监测策略。最近对接受治疗意向手术的结肠直肠癌患者的研究报告说，在所有患有最终复发但不能在无病患者的患者中，切除后确定了cfDNA [10]。

 

尽管肺癌液体诊断有希望，但仍然存在重大挑战。在肿瘤异质性的存在下，cfDNA采样是否提供了整体肿瘤生物学的可靠分子代谢以及血浆或组织是否是疾病分子表征的真正参考标准是不确定的。迫切需要进一步研究评估在cfDNA中识别的遗传改变的预测效用，而不依赖于通过组织询问识别的那些。此外，目前，没有广泛接受的标准可用于处理样品，这可能有助于不同的测试结果。性能验证和方法开发，包括最佳准备策略（收集，分离和存储cfDNA）和下游分析需要认真正式化。竞争平台实验室之间的协调和沟通有助于促进这一进程。最后，鉴于报告的不同平台的敏感性和特异性的广泛范围，对于前瞻性治疗试验来说，必须要求血浆和/或血清的采集与组织的重复性一致率与临床验证有关。应特别注意临床（肿瘤负荷）和抽样变量对这些平台的准确性和可重复性的影响。重要的是要注意，迄今为止，很少（如果有的话）出版的系列已经评估了具体商业平台的准确性或其与成对组织的一致性。因此，在解释结果时应谨慎使用。此外，许多这些检测的检测阈值已经任意设定，具有不同的内部截止水平，从而使某些结果的解释具有挑战性。

 

除了技术上的考虑，液体平台的应用可能会产生新的治疗困境。例如，是否应执行cfDNA中EGFR或T790M的药效学监测，并指导临床或放射学进展前的治疗决策，对于接受TKI治疗的患者尚不清楚。同样，在治疗意向治疗之后，是否仅在等离子体中鉴定的最小残留病变治疗可改善患者的生存率也是未知的。应该追求评估由等离子体测试引发的治疗决定的前瞻性试验，独立于临床或放射学检查结果，对于早期和晚期阶段的患者。买球网期待液体平台的进一步发展和完善及其日常使用不准确地识别NSCLC各阶段的复发和从头疾病和基因分型患者。